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培养基的灭菌流程
优质回答原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料.由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等.另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压.
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质,是应用最广的凝固剂.加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化,于45℃以下凝固.但多次反复融化,其凝固性降低.
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌,以备纯培养用.一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌.
3材料
3.1器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱.
3.2药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液.
4流程
称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板.
5步骤
5.1培养基的制备
5.1.1称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的烧杯中,琼脂不要加入.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.
5.1.2溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中,在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻棒搅拌,以防液体溢出.待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分.如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,并在火上加热搅拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,补足水分.
5.1.3调节pH
根据培养基对pH的要求,用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH.测定pH可用pH试纸或酸度计等.
5.1.4溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂.琼脂加入后,置电炉上一面搅拌一面加热,直至琼脂完全融化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热).注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦.
5.1.5过滤分装
先将过滤装置安装好（图3-1）.如果是液体培养基,玻璃漏斗中放一层滤纸,如果是固体或半固体培养基,则需在漏斗中放多层纱布,或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤.过滤后立即进行分装.分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口,以免浸湿棉塞, 引起污染.液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜.固体分装装量为管高的1/5,半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶,其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜.
5.1.6包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽,再包上一层防潮纸,用棉绳系好.在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等.
5.1.7灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌.普通培养基为121℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份.培养基经灭菌后,如需要作斜面固体培养基,则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2),斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后,垂直冷凝成半固体深层琼脂.
5.1.8倒平板
将需倒平板的培养基,于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板.
5.2灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌.
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.
5.2.1.高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）.
5.2.1.1操作方法和注意事项如下
加水
打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线.立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存.注意水要加够,防止灭菌过程中干锅.
装料、加盖
灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气.
排气
打开排气口(也叫放气阀).用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持5min,使锅内冷空气完全排净.
升压、保压和降压
当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升.当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃,20min）后,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀.注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外.
灭菌后的培养基空白培养
灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养,经24h培养无菌生长,可保存备用；斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养.
5.2.2干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌.一般是把待灭菌的物品包装就绪后,放入电烘箱中烘烤,即加热至160～170℃维持1～2h.
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌.凡带有胶皮的物品,液体及固体培养基等都不能用此法灭菌.
5.2.2.1灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌.
5.2.2.2干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内,注意不要摆放太密,以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触.将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h,注意勿使温度过高,超过170℃,器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧.如果是为了烤干玻璃器皿,温度为120℃持续30分钟即可.温度降至60～70℃时方可打开箱门,取出物品,否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂.
用此法灭菌时,绝不能用油、蜡纸包扎物品.
5.2.2.3火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底.对于接种环,接种针或其它金属用具,可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌.此外,在接种过程中,试管或三角瓶口,也采用通过火焰而达到灭菌的目的.
无菌技术的方法和步骤？
优质回答“无菌技术操作流程: 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2、解开无菌包系带卷放在包布下边。 3、用拇指和食指先揭左右两角,最后揭开内角,注意手不可触及包布的内面。用无菌钳(镊)取出一块无菌巾放于治疗盘内,剩余部分按原折痕包起扎好,并注明开包时间。 4、铺无菌盘: 单巾铺盘：双手拇、食指捏住治疗巾两上角外面，轻轻抖开，双折铺于治疗盘上，内面为无菌区，盖的半幅成扇形折到对面无菌盘上，开口边向外，放入无菌物品后，边缘对齐盖好。将开口处向上翻折两次，两侧边缘向下翻一次，以保持无菌。
双巾铺盘：双手捏住无菌巾的左右两上角的外面，轻轻抖开，由远向近铺于治疗盘上，无菌面向上，放入无菌物品。依上法夹取另一块无菌巾，由近侧向对侧覆盖于治疗盘内上，边缘多余部分反折，不应暴露无菌区。
5、打开无菌容器盖，必须把盖的无菌面（内面）向上，放在稳妥处，夹取所需物品放入无菌盘内后立即盖严。
6、倒无菌溶液，仔细检查核对溶液后，面对瓶签两拇指将橡皮塞向上翻转，再用一拇、食指将橡皮塞拉出，用食、中指套住橡皮塞，另一手（或同一只手）握住瓶签倒出少许溶液冲净瓶口，再由原处倒出所需溶液于无菌容器中，套上瓶塞并消毒翻转部分与瓶颈（从非污染处到污染处）后立即盖好，并注明开瓶时间。
7、打开无菌盘上层无菌巾一部分，核对无菌手套袋上所注明的手套号码、灭菌日期和消毒指示胶带，然后将手套袋摊开，取出滑石粉包，将粉擦于手掌、手背和指间，以一手掀起手套内袋开口处，另一手捏住手套翻折部分（手套内面）取出手套，使手套的两拇指相对，一手伸入手套内戴好，再以戴好手套的手伸入另一手套的反折部分，依法戴好另一手套，将反折部分翻转套在工作服衣袖外面，揭开无菌盘进行无菌操作。
8、持无菌容器时应托住底部，不可触及容器内面及边缘。
9、开包递送无菌物品时，一手托起无菌包，另一手打开无菌包一角，将带子卷起夹在托包的手指缝内，另一手依次打开其它三角并抓住递送或稳妥地将包内物品放入无菌容器中（无菌区域内）。
10、操作完毕，从手套口翻转向下脱去手套，整理用物。
无菌操作六项步骤是什么?
优质回答1、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。
2、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。
3、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。
4、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。
5、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。
6、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。
扩展资料：
无菌操作技术及注意事项：
1、玻璃器皿的消毒和清洁
⑴新购玻璃器皿的处理
新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。
⑵污染玻璃器皿的处理
①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。
②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。
③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。
④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。
⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。
⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。
2、无菌器材和液体的准备
将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。
对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。
3、无菌操作过程在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。
在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。
4、常用清洁液的配制法
⑴重铬酸钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此时可产生高热，应防止容器破裂。重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。
如清洁效力较差，可再加入少量重铬酸钾及浓硫酸，还可继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。配制重铬酸钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿时，应特别注意防止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。
⑵磷酸三钠将其配成5%～10%水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。
⑶硝酸清洁液将其配成50%水溶液，可用于清洁微量滴定筒。
⑷乙二胺四乙酸二钠（EDTA钠盐）将其配成5%～10%水溶液，可洗脱粘附于玻璃器皿内壁的白色沉淀物。
⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤粘附有血液血清等蛋白质的吸管、试管等。
参考资料来源：百度百科－无菌操作
包扎移液管、试管和三角瓶时,要注意哪些问题?
优质回答1.移液管的包装
准备好干燥的移液管，在距其粗头顶端约0．5cm处，塞一小段约1．5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支移液管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角，并将左端多余的一段纸覆折在移液管上，再将整根移液管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多移液管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。如果有装移液管的铜筒，亦可将分别包好的移液管一起装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的移液管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将移液管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。
2.试管和三角烧瓶等的包装
试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。
空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。
如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。
化验室中试管,吸管,培养皿,平板计数琼脂,生理盐水,乳糖胆盐发酵培养基应该怎样灭菌及灭菌要求?
优质回答您好！
这几项的灭菌都以高压蒸汽为好。高压灭菌方法
1.将待灭菌器材、试剂放入高压蒸锅内，装液体的瓶中液体不能超过2/3，盖紧盖子后松动一圈，或用铝箔纸包紧；
2. 高压灭菌开始时，先打开排气口，待热水蒸气排出数分钟后，关闭阀门灭菌，121度，20分钟。待压力降到0后放气；
3.灭菌后，让瓶子冷却，并及时扭紧瓶盖；
4.可以将高压蒸锅盖留一条缝，在加热至100度，冷却后高压蒸锅内的器材也自动烘干了。
5. 一般器材开15-20分钟即可，液体30分钟。
注：
1． 有时装液体的瓶子可能破裂，可将瓶子放在钢制托盘中，防止瓶子一旦破裂时，试剂流入高压锅内。
2． 高压灭菌全过程中，应有专人看护。
3． 强酸、强碱、挥发性液体、爆炸性物质不能开蒸锅。
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